環氧樹脂生產廢水中含有大量NaCl，對生化處理干擾極大，處理難度和處理成本很高，屬于典型的高鹽度難降解工業廢水。目前對此類高含鹽廢水的處理方法主要有物化法、生物法和物化-生化聯合法等。自然界中的耐鹽菌生活在鹽湖、鹽堿湖和海水中，耐受鹽度最高可達20%，這些耐鹽菌的存在為高鹽廢水的生物處理提供了可能。近年來耐鹽菌已應用于榨菜腌制廢水、高含鹽皂化廢水等高鹽廢水的處理，其中耐鹽菌的篩選成為生化處理的關鍵步驟。本研究從廢水生化處理系統的活性污泥中分離篩選獲取耐鹽菌，進行分子生物學鑒定及生長特征考察，研究耐鹽菌在環氧樹脂廢水的降解特性，以期為此類含鹽樹脂廢水的處理提供技術支持。
1、材料與方法
1.1 實驗材料
實驗用水取自上海某化工廠環氧樹脂生產混合廢水，經Fenton氧化預處理后稀釋，并補充適量營養物質，其水質如表1所示。
菌種 >
無機鹽培養基：MgSO4•7H2O0.2g/L，KH2PO40.5g/L，NH4Cl0.5g/L，K2HPO41.5g/L，NaCl(5~200g/L，按需調節)，1mL微量元素溶液。微量元素：CoCl22g/L，NiCl•26H2O0.05g/L，ZnCl20.05g/L，CuCl20.03g/L，FeCl•36H2O2g/L，MnCl20.5g/L，EDTA1g/L，pH為7.0。
斜面培養基：蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl5g，KH2PO42g，NH4Cl1g，蒸餾水1000mL，瓊脂20g，pH為7.0。
1.2 實驗方法
1.2.1 耐鹽菌株篩選
采用逐步提高NaCl濃度對耐鹽菌群進行篩選培養。從上述2種污泥中各取2.5g，加入滅菌的裝有100mL無菌水的250mL三角瓶內，并加入質量為無菌水0.01%的焦磷酸鈉，搖床震蕩將菌膠團打碎。用無菌移液管吸取上述泥水混合物，在150r/min、37℃恒溫搖床培養72h后，以10%(體積分數)的接種量轉入NaCl質量分數為5%的無機鹽培養基中馴化培養(每代3組平行實驗，傳至10代)，直至無機鹽培養基中的NaCl質量分數達到15%，馴化結束。將馴化得到的菌株接種至含有環氧樹脂生產廢水(COD1000mg/L)的無機鹽培養基中，37℃下搖床培養72h，得到目的菌種篩選結束。
挑取上述分離出的單菌落，用涂布法瓊脂平板分離后，將瓊脂平板倒置37℃恒溫培養箱內培養72h。待瓊脂平板上的菌種長成菌落后，接種保存于斜面培養基上富集，于4℃冰箱保存備用。
采用經典分類法與16SrDNA序列分析相結合的方法確定菌株分類種屬。對篩選后的活化菌株測序，在Genebank數據庫中進行BLAST比對，以獲得最相近的典型菌株16SrDNA基因序列，與數據庫中相似性高的典型菌株序列用ClustalX1.8軟件進行對位排列，用MEGA6.1軟件構建系統發育樹。
1.2.2 菌株生長曲線
2菌株生長曲線用NaCl調節無機鹽培養基鹽度梯度(質量分數)為2%、4%、6%、10%，用NaOH溶液準確調節pH至7.0。富集后的菌株在液體無機鹽培養基中過夜培養，然后分別取10mL菌懸液接種到100mL含不同濃度NaCl的無機鹽培養基中，于37℃搖床恒溫好氧培養，每2h取樣1次測定菌液OD600
以上培養基及藥劑分別在121℃高壓滅菌30min后備用。
1.2.3 耐鹽組合菌投加比的確定
用上述耐鹽菌篩選得到耐鹽菌X1、X2、X3，保持各自菌懸液的OD600在1.2左右，規定每1mL菌懸液為1份。按正交試驗表將菌懸液組合成所需比例，取5mL復合菌懸液投加至50mL廢水中，置于生物搖床中37℃培養24h，測定水中COD，考察各種組合比例的廢水處理效果，以確定最佳比例。
1.2.4 投加耐鹽組合菌的生物處理
環氧樹脂生產混合廢水經Fenton氧化預處理后，調整至適宜鹽度并補充適量的營養物質，取處理后的廢水50mL加入250mL三角瓶中，按試驗設計條件分別加入耐鹽組合菌懸液，考察其對廢水COD的去除情況。
1.3 分析方法
OD600由UV-4802H紫外分光光度計測定也尤尼柯(上海)儀器有限公司頁，CODCr按HZ-HJ-SZ-0108測定，氨氮按HJ535要2009測定，pH測定采用pHS3C型pH計(上海雷磁儀器廠)。
2、結果與討論
2.1 耐鹽菌株的篩選
2種混合活性污泥經馴化篩選、富集培養和分離純化后，共篩選出3株耐鹽菌，分別命名為X1、X2、X3。用GenBankBlast軟件進行序列同源性比較，3株菌株均表現出高度的同源性，16SrDNA序列分析為基礎構建的系統發育樹如圖1所示，分別確定菌株X1為產堿菌(Alcaligenes)、X2為假單胞菌(Pseudo鄄monas)、X3為芽孢桿菌(Bacillus)，具有耐鹽性。
2.2 耐鹽菌株生長曲線
以菌液OD600為縱坐標，培養時間為橫坐標，分別繪制3株耐鹽菌株的生長曲線，如圖2所示。
由圖2可知，X1、X2能在質量分數為2%~10%的NaCl環境中生長，X3可在2%~6%的NaCl環境中生長，但鹽度對菌株生長速率有很大影響。隨著鹽度的增加，菌株生長曲線的適應期變長，對數增長期的生長速率變慢。適應期變長的原因在于，接種到不同的鹽度環境后，微生物需經過一定時間的調整和適應，自身合成多種酶進一步完善體內的酶系統后，才會生長繁殖。而在高鹽環境下酶合成速度下降，產生新的酶系統需要耗費一定時間。在對數生長期微生物雖然處于營養過剩狀態，但對數增長期增長速率變慢。高鹽環境下微生物在抵御外在不良環境的同時，需要耗費大量能量調整自身的代謝途徑，或分泌胞外多聚物抵御外界不良環境因子的作用，同時需要能量合成自身生長所需物質。這樣導致用于生長繁殖的能量相對減少，自身生長速率變小，世代時間變長。減速生長期歷時變長可能是由于微生物利用底物的速率下降，微生物存活率低，導致營養物質剩余。
2.3 耐鹽組合菌的生物處理
2.3.1 耐鹽組合菌投加比的確定
研究表明，利用優勢菌株(如耐鹽菌)降解有機污染物已成為有機廢水處理的有效方法，其中微生物菌群處理有機物的效率要高于單一菌株。因此，對已分離出的3株耐鹽菌用正交試驗確定X1、X2、X3組合比例，以獲得高效處理環氧樹脂生產廢水的復合耐鹽菌群。正交試驗結果如表2所示。
由表2可見，最優水平組合為A2、B2、C3，故3種耐鹽菌X1：X2：X3最佳投配比為2：2：3(體積比)。
2.3.2 耐鹽組合菌對Fenton預處理廢水的降解效果
實驗固定4個因素，調整另一因素，考察廢水COD的去除效果，如表3、圖3所示。
(1)鹽度。由圖3(a)可見，NaCl質量分數為5%~8%時，組合耐鹽菌對廢水中有機物的降解效果在80%以上。當NaCl為15%時，COD去除率急劇下降，這是由于隨著鹽度增加，菌株生長速率變慢，酶的合成受到限制，有機物降解速率減慢。故組合微生物最適NaCl為5%~8%。
(2)反應時間。由圖3(b)可見，生物搖床37℃恒溫反應6h，廢水COD去除率達54%，反應12h后去除率在70%左右，24h后去除率上升了3%，隨著接觸時間的延長，12~48h內COD去除率沒有明顯變化，仍保持在80%以下。
(3)溫度。圖3(c)中廢水COD去除率隨著溫度的升高逐漸升高，在37℃時達到最大值91%左右，當溫度達到40℃時，COD去除率反而降低，主要是因為高溫會抑制微生物的活性，從而降低廢水COD去除率，故組合耐鹽菌降解有機物的最適溫度為37℃。
(4)pH。圖3(d)顯示，pH為7時廢水COD去除效果理想，COD去除率達到85%左右，pH為5、6時，COD去除率分別在73%、65%左右，pH為9時，COD去除率只有30%左右。因此，耐鹽組合菌在pH為7時COD去除效果最理想，pH過低或過高均會影響微生物的活性，減少有機物的降解率。
(5)投菌量。由圖3(e)可見，廢水COD去除率隨投菌量的增加而不斷增加，投菌量為5%時COD去除率比3%時的去除率明顯提高，菌體投加量為5%、10%時，COD去除率分別為80%、94%。投菌量為12%時COD去除率為98%，但相對于10%的降解率增幅有限，故選擇最佳投菌量為10%。
綜上所述，在適合耐鹽菌生長環境下，用其處理Fenton預處理后的廢水，COD去除率維持在70%~80%。通過單因素試驗確定最佳實驗條件：廢水pH為7，反應時間為24h，反應溫度37℃，廢水中NaCl質量分數為5%~8%，耐鹽組合菌最佳投加量為廢水體積的10%。
3、結論
(1)對環氧樹脂生產廢水處理系統及城鎮污水處理生化池中的活性污泥進行馴化，篩選出3株能高效降解廢水COD又可在高鹽度環境中生長良好的耐鹽菌，命名為X1、X2、X3。采用16SrDNA序列分析方法進行鑒定，分離篩選得到3株耐鹽菌株分別為X1屬產堿菌(Alcaligenes)、X2屬假單胞菌(Pseudomonas)、X3屬芽孢桿菌(Bacillus)。
(2)通過正交試驗確定3株菌株組合最佳投配比為2：2：3(體積比)，用該組合菌處理Fenton預處理后鹽度為5%~8%的廢水，耐鹽組合菌最佳投加量為廢水體積的10%，在pH為7、37℃下搖床反應時間24h，能保持較高的COD去除率。( >
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